5754 503 - le diagnostic de la drépanocytose par l'analyse de l'ADN

TP : le diagnostic de la drépanocytose par l'analyse de l'ADN

Des débuts de la génétique aux enjeux actuels des biotechnologies

Problématique : comment distinguer un ADN "normal" d'un ADN muté par la technique de Southern (cf manuel p.104) ?

Mots-clés : enzyme de restriction, electrophorèse.

Transmission de la drépanocytose ↓
L'action des enzymes de restriction ↓
Reconnaissance par une sonde monolocus ↓
Guide, Matériel

1 Transmission de la drépanocytose

document 1 : arbre généalogique de la famille de Mme X

La drépanocytose (ou anémie falciforme) est une maladie génique due à la mutation du gène codant la chaîne β de l'hémoglobine. Comme cette chaîne n'est synthétisée par les globules rouges qu'après la naissance (cf TP d'enseignement obligatoire La famille des globines), il est impossible de diagnostiquer directement la maladie chez le foetus par une électrophorèse d'hémoglobine (cf cours de première S). Le remplacement d'un acide aminé dans la chaîne protéique provoque sa polymérisation spontanée en longues fibres qui déforment les globules rouges et limite leur passage dans les capillaires. L'oxygénation des tissus est ralentie et les hématies sont fragilisées.

Cette maladie est liée à un allèle récessif d'un gène autosomal. La probabilité pour un individu quelconque d'être hétérozygote pour l'allèle morbide de la drépanocytose est de 1%.

Calculez le risque pour le foetus (représenté en pointillé sur le document) d'être malade.

2 L'action des enzymes de restriction

L'enzyme Eco RI reconnaît la séquence :
5'...GAATTC...3' ...CTTAAG...
et la coupe après le G initial : G/AATTC. L'enzyme Hind III reconnaît la séquence :
5'...AAGCTT...3' ...TTCGAA...
et la coupe après le A initial : A/AGCTT L'enzyme ER I reconnaît la séquence :
5'...CCTGAGG...3' ...GGACTCC...
et la coupe après le C initial : C/CCTGAGG

Lancez le traitement de texte et chargez le fichier betaglobine_adn.seq

Utilisez le guide et choisissez l'enzyme le plus adapté pour différencier l'allèle β^a et l'allèle β^s. Justifiez votre choix et expliquez pourquoi la mutation modifie la longueur de certains fragments de restriction.

3 Reconnaissance par une sonde monolocus

Déterminez en utilisant les documents 2, 3 et 4, la taille des fragments de restriction correspondant au gène normal d'une part et au gène muté d'autre part. Expliquez votre raisonnement. D'après les résultats, le foetus sera t-il atteint de drépanocytose ?

p.104 du manuel, c'est une autre enzyme de restriction que celles proposées ici qui est utilisée, de plus tous les fragments d'ADN obtenus sont repérés (il ne s'agit pas d'une sonde monolocus).

document 2 : la technique du «Southern blot» (mise au point par E. Southern) permet de repérer la présence d’une séquence précise dans I’ADN d’un sujet. Pour cela, plusieurs étapes sont nécessaires :

l’ADN humain "total" est traité par une enzyme spéciale, dite de restriction, qui coupe l’ADN chaque fois qu’elle rencontre une séquence particulière de nucléotides et produit ainsi plusieurs centaines de milliers de fragments de tailles différentes (chacun comportant de quelques centaines à quelques milliers de nucléotides);
ce mélange est disposé dans un puits, l'extrémité d’une plaque de gel d’agarose, puis soumis à une électrophorèse qui provoque une migration des fragments dans le gel, les plus petits étant les plus rapides;
après dénaturation de I’ADN (séparation sur place des brins complémentaires), la plaque est mise au contact d’un filtre spécial qui recueille une empreinte (« blot ») du gel, les fragments d’ADN conservant leurs positions respectives;
le filtre est immergé dans une solution contenant une sonde moléculaire radioactive puis, après incubation de quelques heures à 65°C pour permettre la fixation de la sonde sur les fragments complémentaires, le filtre est rincé de façon à éliminer le molécules de sonde non fixées;
le filtre est autoradiographié, ce qui révèle l’emplacement de la sonde radioactive, donc des fragments d’ADN humain qui lui sont complémentaires.

animation : www.ac-creteil.fr/biotechnologies/swfile.htm/Southern Blot ave preload.swf

document 3 : on dispose d'une sonde moléculaire qui reconnaît une portion d'ADN empiétant sur le début du gène de la β globine. La technique est extrêmement sensible (même si un seul fragment, sur les centaines de milliers présents au départ, contient la séquence complémentaire de la sonde, il est repéré). Elle permet en outre de faire la recherche simultanée sur une vingtaine d'échantillons d’ADN, provenant par exemple d'autant d'individus différents.

sens de migration
↓
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document 4 : électrophorèse d'ADN d'un sujet sain (A), d'un sujet malade (B) et du foetus porté par Mme X (C).

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