TP : la phase photochimique de la photosynthèse : colorimétrie  (guide)

L'origine du dioxygène ↓ Pouvoir réducteur d'un extrait de chloroplastes ↓ Réduction du DCPIP ↓   TP

1 L'origine du dioxygène

Equation globale de la photosynthèse réécrite :

2 Pouvoir réducteur d’un extrait de chloroplastes

• Broyez quelques feuilles d’Epinard ou de Cresson dans un mortier (pour les épinards, une feuille suffit, enlevez les pétioles); vers la fin du broyage, ajouter 20 ml de tampon phosphate.
• Filtrez sur un coton pour éliminer les grosses particules; assurez vous que la couleur verte n'est pas trop intense et ne masque pas celle du DCPIP, diluez si nécessaire avec du tampon et remplissez un petit tube ou une cuve à colorimétrie (environ 3mL); la centrifugation du filtrat pour isoler les chloroplastes peut être réalisée, mais elle n'est pas indispensable.
• Ajoutez 0,5mL de DCPIP avec la seringue, agitez; bouchez soigneusement sans laissser d'air; attendre une minute; si la solution se décolore, diluer davantage la totalité du filtrat. Idéalement la décoloration doit survenir en 5 à 10min. Remplissez un deuxième tube comme le premier et placez-le à l’obscurité (papier d'aluminium ou cache noir sur la cuve à colorimétrie).

Comparez les temps de décoloration. Deux témoins avec du tampon + DCPIP seront réalisés au bureau (l'un à la lumière, l'autre à l'obscurité).

3 Suivi de la réduction du DCPIP

• Installez l'alimentation du colorimètre; réglez la longueur d'onde à 585nm (jaune, c'est la plus absorbée poar le DCPIP qui est bleu); branchez le colorimètre sur la première entrée directe de la console : bornes noire et rouge (ou sur l'adptateur voltmètre de la console), pour mesurer l'absorbance.
  
• Lancez le logiciel Serenis selon les procédures habituelles.
  
• Sélectionnez l'entrée Directe/ (ou le Voltmètre et le calibre 2.5);
  
  (si l'adaptateur Voltmètre est utilisé, vérifiez que le bouton DC est bien coché;)
  
  pipetez 3mL de suspension de chloroplastes dans la cuve à colorimétrie, ajoutez 0,5mL de DCPIP avec la seringue et pipetez 0,5mL de solution d'hydrosulfite de sodium; placer la cuve dans le colorimètre face polie contre la diode jaune; mettre le cache noir sur la cuve;
  
  faire le zéro en appuyant sur le bouton rouge du colorimètre (et en cliquant en même temps sur le bouton Réglage du zéro de la boite de dialogue); conservez cette cuve pour refaire ultérieurement le réglage du zéro. Remarque : l'hydrosulfite maintient le DCPIP à l'état réduit donc incolore. Il n'est pas indispensable de boucher cette cuve.
  
• Paramétrez pour une durée d'aquisition de 362s, une mesure toutes les 60s (7 points).
  
• Remplissez la cuve avec la suspension de chloroplastes; ajoutez 0,5mL de DCPIP; fermez avec le bouchon sans laisser d'air; placez le cache du colorimètre.
  
• Lancez l'acquisition; ne placez la cuve dans le colorimètre que le temps de la mesure qui sera automatique (donc toutes les minutes : utilisez le chronomètre affiché par le logiciel ); entre-temps, placez la cuve devant une source lumineuse, toujours à la même distance; efforcez vous de laisser la cuve le plus longtemps possible devant la source lumineuse.
  
• Enregistez la courbe dans votre espace personnel.
  
• Chaque groupe réalisera un deuxième essai, soit en maintenant la cuve à l'obscurité sous un cache entre les mesures (laissez là dans le colorimètre et éteignez la diode), soit avec des chloroplastes bouillis; il est conseillé de superposer le graphe au précédent (grâce à la boite de dialogue qui apparait lors du lancement de l'acquisition); enregistez la (les) courbe(s) dans votre espace personnel.